用单个锥形光纤植入物进行深度分辨光纤光度测定

用1个锥型光钎线值入物使用深层甄别光钎线光度旋光度的测定（转译自专著Depth-resolved fiber photometry with a single  tapered optical fiber implant） 活体荧光检查可以利用于记下表和分析只有运转植物脑深部基因遗传定位的周围神经末梢群的性能4g信号。举例说明，棉纤维光度法借助数据监测某一生殖细胞款式周围神经末梢话动时荧光马上间发展趋势来达到。这样的做法推向了源于激光学和光電子平台网站技术性应用甚至利用多路复用技术性技术性应用记下表两个亚类群话动做法的发展趋势。一般问题下，光仟测量方法设计忽略于圆形打孔光仟通过刺击和汇集荧光2-9,11 - 19。

然而，由于组织散射和吸收效应，扁平切割光纤的可访问记录深度仅限于光纤jian 端附近，这与探针的几何形状相结合，决定了荧光激发和收(shou)集(ji)(ji)效率20,21。简单的(de)(de)几何计算表明，扁(bian)平(ping)(ping)切割(ge)光纤收(shou)集(ji)(ji)的(de)(de)信号量(liang)随着与光纤面距离的(de)(de)增加而急(ji)剧减少。此外，重新(xin)配置(zhi)收(shou)集(ji)(ji)几何形状以(yi)达(da)到多个区(qu)域(yu)是不可能的(de)(de)，因(yin)为改(gai)变光收(shou)集(ji)(ji)场需要重新(xin)定位(wei)光纤。此外，扁(bian)平(ping)(ping)切割(ge)光纤的(de)(de)几何形状严重损害组织，在(zai)大(da)脑中，甚至在(zai)植(zhi)入后很长一段(duan)时间(jian)内(nei)，也(ye)会诱导装置(zhi)周围的(de)(de)神经胶质激活22,23。尽管如此，平(ping)(ping)劈(pi)光纤被广泛用于评估脑深部区(qu)的(de)(de)神经活动3,11-19。

在这里，我们提出了一种克服这些限制的方法:我们利用TF中光传播的模态特性在锥度的大光学活性区域上构造光收集模式并进入更深的细胞。除了比扁平切割光纤22具有更小的侵入性外，TF探针还具有du 特的(de)光收(shou)集特征，包括:(i)沿(yan)光纤(xian)轴在高达2mm的(de)组织上(shang)具(ju)有(you)均匀的(de)界面，(ii)通过分时多(duo)路复(fu)用(yong)沿(yan)锥(zhui)(zhui)度(du)进行多(duo)点收(shou)集的(de)能力，以及(iii)通过微(wei)结构光纤(xian)锥(zhui)(zhui)度(du)的(de)非平面表面来设计任意收(shou)集体积的(de)能力。

下面，我们量化了锥形光纤的(de)(de)三维(wei)(3D)光(guang)(guang)采集(ji)(ji)区(qu)域(yu)，发现(xian)锥形光(guang)(guang)纤(xian)(xian)在大(da)(da)区(qu)域(yu)(如小(xiao)鼠(shu)的(de)(de)大(da)(da)脑皮(pi)质和纹状(zhuang)体)均匀地收集(ji)(ji)荧光(guang)(guang)。当与大(da)(da)面(mian)积(ji)光(guang)(guang)传输相结(jie)合时(shi)22,24，这(zhei)导致在有源光(guang)(guang)学表(biao)面(mian)相似的(de)(de)照明(ming)功(gong)率密度(du)下，锥形光(guang)(guang)纤(xian)(xian)比(bi)扁(bian)平(ping)切割光(guang)(guang)纤(xian)(xian)的(de)(de)信号采集(ji)(ji)更高。这(zhei)是因(yin)为(wei)大(da)(da)面(mian)积(ji)的(de)(de)锥形光(guang)(guang)纤(xian)(xian)可(ke)以提(ti)供更多的(de)(de)总照明(ming)功(gong)率，即(ji)更多的(de)(de)光(guang)(guang)子，同(tong)时(shi)将(jiang)电(dian)池(chi)暴(bao)露(lu)在中等的(de)(de)功(gong)率密度(du)下。我们的(de)(de)研究表(biao)明(ming)，通过利(li)用选择(ze)性(xing)光(guang)(guang)传递和收集(ji)(ji)，转录因(yin)子能够在自由运动的(de)(de)动物中对(dui)功(gong)能性(xing)荧光(guang)(guang)信号进行(xing)(xing)多点探测，包括沿(yan)着纤(xian)(xian)维(wei)锥度(du)动态记录来自多个脑区(qu)的(de)(de)信号。我们通过在自由运动的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)中使用单个锥形光(guang)(guang)纤(xian)(xian)完成(cheng)奖励收集(ji)(ji)任务，快速扫描兴奋光(guang)(guang)并同(tong)时(shi)监测背(bei)侧和腹侧纹状(zhuang)体的(de)(de)多巴胺瞬变，证明(ming)了这(zhei)种(zhong)实(shi)验的(de)(de)可(ke)行(xing)(xing)性(xing)。

zui后，我(wo)们(men)将(jiang)控(kong)制(zhi)光(guang)沿锥度(du)传播(bo)的(de)模态效(xiao)应与金属涂(tu)层锥形光(guang)纤(xian)表(biao)面的(de)微观和纳(na)米(mi)结(jie)构相结(jie)合，从(cong)而设计(ji)了收集体积25,26。我(wo)们(men)将(jiang)收集体积限(xian)制(zhi)在锥度(du)表(biao)面的(de)一(yi)个角(jiao)部分，这(zhei)样，光(guang)学(xue)窗(chuang)口位(wei)于沿着锥形光(guang)纤(xian)界面的(de)特(te)定深度(du)，只有很少的(de)细胞(bao)体。这(zhei)种方法与光(guang)学(xue)窗(chuang)口的(de)选择性光(guang)传输(shu)相结(jie)合，提供了具(ju)有高度(du)空间(jian)选择性的(de)深度(du)细胞(bao)体积的(de)双向(xiang)接口。

 

毕竟

碗形电(dian)信(xin)光(guang)纤的(de)光(guang)获取(qu)因素(su)

图1 |锥形光纤的光收集。a，脑组织中扁平切割光纤（FF）和锥形光纤(TF)的光采集示意图。实验收集概况旁边的纤维。b，对锥形光纤的光采集场成像的光学设置。在pbs -荧光素滴中，一个围绕锥形光纤的双光子激发点被扫描。产生的荧光可通过未脱膜的PMT(显微镜PMT)和补片光纤远端的光纤PMT检测。Ls，透镜系统；F1和F2，带通荧光滤波器；L2,镜头。c，在PBS-荧光素溶液中，随着NAs的增加锥形光纤的典型ξT(x,y)集合字段(每个字段归一化到其zui大值);比例尺，500µm。d，比较在pbs -荧光素溶液中扫描的双光子荧光光斑采集的光子数(像素停留时间，3.2µs)，内嵌扁平切割光纤与NA = 0.66， ψ = ~4°的锥形光纤；FF图中的等值线显示锥形光纤收集到的zui大光子数。比例尺，500µm。e, NA-0.66 锥形光纤在pbs -荧光素溶液中的光子收集的等距线(顶部色条，每个像素的光子数;停留时间，3.2µs)；等值线在10、20、50和100光子处绘制。比例尺，500µm。f，上，远场成像系统示意图。L1、L2、L3，成像镜；BPF，带通滤波器;NBF，近红外阻断(duan)滤波器；sCOMS，科(ke)学(xue)互补金属(shu)氧化物半(ban)导体。底部，纤(xian)维输(shu)出(chu)小关(guan)节的(de)(de)远场(chang)图像(xiang)显(xian)示，当光(guang)(guang)(guang)源沿着锥(zhui)形(xing)光(guang)(guang)(guang)纤(xian)移动时，直径增加的(de)(de)环。比(bi)例尺，0.3 2π/λ。g, 锥(zhui)形(xing)光(guang)(guang)(guang)纤(xian)在距离锥(zhui)尖d处(chu)采(cai)集(ji)的(de)(de)点(dian)状光(guang)(guang)(guang)源荧光(guang)(guang)(guang)的(de)(de)横向(xiang)矢量分量kt。a-d的(de)(de)实验重复了至(zhi)少(shao)10次，得到了相似的(de)(de)结(jie)果。

我们在准透明的荧光溶液中表征了锥形光纤的光聚集特性(图1)。我们在浸泡锥形的pbs荧光素(30µM)液滴中实现了一个双光子扫描系统，以产生局限的荧光斑，就像各向同性的点状源一样(图1b)。光栅扫描锥度周围光斑时产生的荧光由与扫描头同步的两个光电倍增管(PMT)收集:(i)显微镜PMT，放置在标准的非脱封，外荧光路径，和(ii)光纤PMT，置于连接的光纤贴片的远端至锥形光纤20、21(图1b)。用显微镜PMT得到的参考图像对视场中双光子激发效率的轻微不均匀性进行校正后，来自光纤PMT的信号报告了锥形光纤的荧光光采集场，定义为ξT(x,y)。测量了不同数值孔径(NAs)和(he)芯径，但锥度(du)角(ψ)近(jin)似为~4°的(de)(de)(de)(de)光纤(xian)的(de)(de)(de)(de)集合场ξT(x,y)(图1c)。我们(men)发(fa)现(xian)沿锥度(du)的(de)(de)(de)(de)光敏(min)区域，即收(shou)集长(zhang)度(du)L，随(sui)着(zhe)光纤(xian)NA的(de)(de)(de)(de)增(zeng)(zeng)大(da)和(he)ψ的(de)(de)(de)(de)减小而增(zeng)(zeng)大(da)(补充(chong)图1a)。因此，锥形(xing)光纤(xian)的(de)(de)(de)(de)采集长(zhang)度(du)是可(ke)以定制的(de)(de)(de)(de)通(tong)过修改光纤(xian)NA和(he)锥度(du)角ψ，从几(ji)百微(wei)米提高到约2 mm。这一发(fa)现(xian)揭示了锥形(xing)光纤(xian)和(he)扁平切(qie)割(ge)光纤(xian)的(de)(de)(de)(de)收(shou)集特性的(de)(de)(de)(de)重要差异，因为对于(yu)(yu)扁平切(qie)割(ge)，收(shou)集深度(du)基本(ben)上不依赖(lai)于(yu)(yu)NA21。

我们比较了锥形光纤和扁平切割的采集字段，NA分别为0.66(图1d)和0.39(补充图1b)。锥形光纤的光学主动表面沿波导轴线延伸，导致沿锥度方向相对均匀的收集。从集合字段ξF(x,y)中可以看出，扁平切割光纤在端面附近采集到较高的信号强度。相反，锥形光纤的收集效率曲线在锥度面附近达到一个较低的zui大值，并遵循在jian 端增宽(kuan)的两叶形状(zhuang)(图(tu)1e和补(bu)充图(tu)1c、d和2)如(ru)图(tu)ξ(x,y,z)区域所示(补(bu)充图(tu)1d)，被采(cai)集信号围绕锥度轴对称。

这是因(yin)为锥形(xing)光纤表(biao)面通过增加波导直径27的(de)(de)横向传播(bo)分(fen)量kt的(de)(de)模(mo)(mo)态子集与周围环(huan)境进行(xing)光学(xue)界面。因(yin)此，由光纤的(de)(de)直部分(fen)所(suo)支持的(de)(de)全(quan)部传播(bo)模(mo)(mo)式逐(zhu)渐沿锥形(xing)填充(chong)，导致锥形(xing)光纤轴的(de)(de)均匀收集。相(xiang)反(fan)，扁平切割(ge)光纤的(de)(de)所(suo)有传播(bo)模(mo)(mo)式都(dou)在纤维面耦合。

为了更好地表征锥度采集光的物理特性，我们从靠近锥度表面的点样点对荧光进行双光子激发时，对所采集光的远场进行成像(图1f)。我们发现不同的模态子集在特定的锥度直径下被填充(图1f,g)，因为相机上的图像是一个环，它的半径随着荧光源和锥度jian 端之间的距离的函数而增加。环半径h是直接测量与进入纤维的导模相关(guan)(guan)的(de)(de)(de)波矢(shi)量(liang)的(de)(de)(de)横向(xiang)分(fen)量(liang)kt 27,28。因此，光线从锥(zhui)体(ti)的(de)(de)(de)不(bu)同(tong)(tong)截面进入，受到不(bu)同(tong)(tong)的(de)(de)(de)引(yin)导(dao)模式子集的(de)(de)(de)引(yin)导(dao)，在相机上产生(sheng)不(bu)同(tong)(tong)直(zhi)径的(de)(de)(de)环，从而建立了(le)h与荧(ying)光信号沿锥(zhui)体(ti)的(de)(de)(de)位(wei)置之间的(de)(de)(de)相关(guan)(guan)性(xing)。

图2 |可重构的锥形光纤光收集。a，与荧光素均匀染色脑片皮质接触的0.66 NA 扁平切割光纤的光采集场ξ(x,y)(左)和光度效率场ρ(x,y)(右)。b，与a一样，将0.66-NA 锥形光纤插入经荧光素均匀染色的脑切片中。c，使用全NA照明和蓝色激光刺激并收集大大脑区域荧光的系统示意图。收集的光在贴片光纤中反向传播，并通过一个二色镜将其导向PMT与蓝光区分开来。L1和L2，晶状体；BPF，带通滤波器；Fluo，荧光信号；Exc，激发光。d，定点照明将采样体积限制在锥形光纤的子区域。左，集光域ξT(x,y)；中心，在光纤jian 端选(xuan)择(ze)性(xing)照明得(de)到的(de)(de)(de)(de)光度(du)(du)效(xiao)率场ρT(x,y)；右，ρT(x,y)视场是在(zai)(zai)较宽锥(zhui)度(du)(du)直径下(xia)选(xuan)择(ze)性(xing)照明获得(de)的(de)(de)(de)(de)。e，提出(chu)的(de)(de)(de)(de)多站点(dian)光度(du)(du)测(ce)(ce)量系(xi)统的(de)(de)(de)(de)原理图，该(gai)系(xi)统使用时(shi)(shi)分复用配置的(de)(de)(de)(de)PMT探(tan)测(ce)(ce)器。蓝(lan)色激(ji)(ji)光束以增加的(de)(de)(de)(de)输入(ru)角(jiao)(θ1， θ2)射入(ru)光纤贴(tie)片线。低(di)角(jiao)度(du)(du)注入(ru)时(shi)(shi)，激(ji)(ji)光在(zai)(zai)锥(zhui)尖(jian)处耦(ou)合(he)，产生荧(ying)光信号F1；相反，当在(zai)(zai)θ2处注入(ru)时(shi)(shi)，激(ji)(ji)光在(zai)(zai)较大(da)锥(zhui)度(du)(du)直径下(xia)耦(ou)合(he)，产生荧(ying)光信号F2。荧(ying)光由PMT检(jian)测(ce)(ce)，其输出(chu)信号与光注入(ru)刺激(ji)(ji)同步。该(gai)荧(ying)光信号根据(ju)其时(shi)(shi)间戳归属于(yu)相应的(de)(de)(de)(de)区域。a、b、d实验重复三次(ci)，结果相似。

在大而(er)深的行政区(qu)域统一化(hua)采集而(er)来

为了证明在存在散射和吸收的情况下，锥形光纤可以在大的和深部脑区获得均匀的采集，我们测量了均匀荧光染色的脑片上扁平切割光纤和锥形光纤的荧光采集场ξ(x,y)和荧光激发场β(x,y)。结合这些场得到了光度测量效率场ρ(x,y)，它描述了荧光信号对激发光强度的(de)(de)(de)依(yi)赖(lai)性20,21，从而(er)给出了(le)采样组(zu)织体(ti)积的(de)(de)(de)详尽几何(he)信(xin)息。我(wo)们(men)(men)(men)比(bi)较了(le)匹(pi)配NA和(he)内核(he)大小的(de)(de)(de)扁(bian)平切割光纤(xian)(xian)(xian)和(he)锥形(xing)光纤(xian)(xian)(xian)的(de)(de)(de)采集和(he)光度(du)视(shi)野。如图(tu)2a所示，插入到皮(pi)层表面(mian)的(de)(de)(de)扁(bian)平切割光纤(xian)(xian)(xian)域(yu)ξF(x,y)和(he)域(yu)ρF(x,y)，扁(bian)平切割光纤(xian)(xian)(xian)有效地与皮(pi)层的(de)(de)(de)浅层连接;然(ran)而(er)，他们(men)(men)(men)只提取了(le)距离透镜面(mian)300 μm以(yi)(yi)外的(de)(de)(de)信(xin)息。相反，锥形(xing)光纤(xian)(xian)(xian)的(de)(de)(de)界面(mian)更均匀(yun)，锥体(ti)的(de)(de)(de)光学活性区域(yu)周围有脑组(zu)织(图(tu)2b)。利用ξ(x,y)的(de)(de)(de)对称性，我(wo)们(men)(men)(men)计算(suan)了(le)由波导采样的(de)(de)(de)体(ti)积作为(wei)采集信(xin)号的(de)(de)(de)函数(补充图(tu)3)，并确(que)定了(le)产生(sheng)给定比(bi)例的(de)(de)(de)总采集信(xin)号的(de)(de)(de)组(zu)织体(ti)积。我(wo)们(men)(men)(men)发现锥形(xing)光纤(xian)(xian)(xian)的(de)(de)(de)体(ti)积比(bi)扁(bian)平切割光纤(xian)(xian)(xian)大(补充图(tu)4)。这一特性可以(yi)(yi)在使(shi)用全(quan)锥度(du)表面(mian)来(lai)激(ji)发和(he)收(shou)集信(xin)号的(de)(de)(de)实验(yan)中(zhong)加以(yi)(yi)利用(图(tu)2c)。

沿锥度可再增加(jia)多班次自身(shen)

使用(yong)位(wei)点(dian)选择性光(guang)(guang)(guang)(guang)传(chuan)(chuan)输和模分(fen)解复(fu)用(yong)策略，锥(zhui)形(xing)光(guang)(guang)(guang)(guang)纤(xian)的(de)(de)收(shou)集(ji)(ji)(ji)量(liang)(liang)可(ke)(ke)以(yi)沿着锥(zhui)度(du)在多(duo)个(ge)位(wei)置(zhi)之(zhi)间(jian)动(dong)(dong)态切(qie)换22,27,28。为(wei)了(le)定义可(ke)(ke)寻(xun)址(zhi)的(de)(de)体(ti)积几何(he)配置(zhi)，我们获得了(le)一个(ge)插入(ru)(ru)到(dao)荧光(guang)(guang)(guang)(guang)素染色(se)脑(nao)片(pian)上的(de)(de)0.66-NA 锥(zhui)形(xing)光(guang)(guang)(guang)(guang)纤(xian)的(de)(de)ξT(x,y)集(ji)(ji)(ji)合域(yu)(图(tu)(tu)2d)。使用(yong)基于振镜(jing)的(de)(de)快速扫描系统(图(tu)(tu)2e)，我们通过增(zeng)(zeng)加kt激(ji)发模态子集(ji)(ji)(ji)将(jiang)激(ji)光(guang)(guang)(guang)(guang)注(zhu)入(ru)(ru)锥(zhui)形(xing)光(guang)(guang)(guang)(guang)纤(xian)，从而将(jiang)照明(ming)(ming)体(ti)积限(xian)(xian)制(zhi)在可(ke)(ke)通过改变光(guang)(guang)(guang)(guang)输入(ru)(ru)角度(du)22、27、28沿锥(zhui)度(du)部分(fen)逐渐移(yi)动(dong)(dong)的(de)(de)有(you)限(xian)(xian)区域(yu)(补充(chong)图(tu)(tu)5a、b)。由(you)(you)于荧光(guang)(guang)(guang)(guang)只在有(you)限(xian)(xian)的(de)(de)被照射(she)组织中产(chan)(chan)生(sheng)(补充(chong)图(tu)(tu)5a、b)，锥(zhui)形(xing)光(guang)(guang)(guang)(guang)纤(xian)可(ke)(ke)以(yi)动(dong)(dong)态地(di)检查一个(ge)功(gong)能区的(de)(de)多(duo)个(ge)位(wei)点(dian)。作(zuo)为(wei)原(yuan)理证明(ming)(ming)，我们结(jie)合ξT(x,y)和β(x,y)，测量(liang)(liang)了(le)由(you)(you)选址(zhi)照明(ming)(ming)产(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)度(du)测量(liang)(liang)效率(lv)场ρT(x,y)。ρT(x,y)在可(ke)(ke)从光(guang)(guang)(guang)(guang)线注(zhu)入(ru)(ru)角度(du)推(tui)断的(de)(de)有(you)限(xian)(xian)区域(yu)内zui大(da)(图(tu)(tu)2d)。利用(yong)这一特性，荧光(guang)(guang)(guang)(guang)信号可(ke)(ke)以(yi)归(gui)因于使用(yong)时(shi)分(fen)复(fu)用(yong)被照亮的(de)(de)大(da)脑(nao)区域(yu)(图(tu)(tu)2e)。这是通过增(zeng)(zeng)加输入(ru)(ru)角(θ1， θ2)将(jiang)激(ji)光(guang)(guang)(guang)(guang)发射(she)到(dao)光(guang)(guang)(guang)(guang)纤(xian)补片(pian)线来激(ji)发沿锥(zhui)度(du)在限(xian)(xian)制(zhi)位(wei)置(zhi)耦合的(de)(de)不同模态子集(ji)(ji)(ji)来实现的(de)(de)。每个(ge)照明(ming)(ming)位(wei)置(zhi)产(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)荧光(guang)(guang)(guang)(guang)(分(fen)别为(wei)F1、F2)由(you)(you)锥(zhui)度(du)采集(ji)(ji)(ji)，在光(guang)(guang)(guang)(guang)纤(xian)补片(pian)线中反向(xiang)传(chuan)(chuan)播，由(you)(you)二色(se)镜(jing)识别，zui后由(you)(you)PMT检测，PMT输出信号与光(guang)(guang)(guang)(guang)注(zhu)入(ru)(ru)刺(ci)激(ji)同步(图(tu)(tu)2e)。

为了(le)证明这种方法对(dui)可能由动(dong)(dong)(dong)物运动(dong)(dong)(dong)引(yin)起的模态混合有弹(dan)性22，我们在pbs -荧光(guang)素(su)浴(yu)中进(jin)行深度分辨(bian)光(guang)度测(ce)量(liang)时，在手(shou)动(dong)(dong)(dong)摇动(dong)(dong)(dong)光(guang)纤贴(tie)片的同(tong)时监测(ce)了(le)远(yuan)场(chang)(chang)模式。记录到的强度波动(dong)(dong)(dong)<1%，远(yuan)场(chang)(chang)环直(zhi)径(jing)和厚度变化<0.8%(对(dui)于未受扰动(dong)(dong)(dong)的纤维;补(bu)充图5c、d和补(bu)充视频1、2)。

图3 |基因染色的神经群增强的光度测定。a，皮质表面0.39-NA 扁平切割光纤的光采集;从左到右:双光子表观荧光(2p-epi)图像，ξ(x,y)场，ρ(x,y)场，轴上采集轮廓ρ(x,y)。b, a为NA = 0.39 扁平切割光纤，接近L5。c, a,b表示一个在大脑皮层插入的0.39 NA的锥形光纤。比例尺(a−c)， 250µm。d，三种实验配置的光度测量系统示意图:一个锥形光纤插入整个皮质，一个扁平切割光纤插入L2/3，一个扁平切割光纤插入至L5。e, Thy1-ChR2-EYFP小鼠脑片的荧光信号强度(n = 10)，在大脑皮层插入0.39 NA 锥形光纤(ψ = 4°)(蓝色)，在L2/3插入0.39- NA 扁平切割光纤(橙色)，在L5插入0.39- NA 扁平切割光纤(紫色)来刺激和检测荧光。调整激光功率以获得相似的光活性区域的功率密度(0.1 mW mm-2)。阴影区域(yu)(yu)表示平(ping)均值上(shang)的标准误(wu)差。灰线连接在(zai)同一实(shi)验(yan)中从同一脑片获得的数据。采用双侧Student t检验(yan)进行统计学分析，显著性α = 0.001。f, 锥形光(guang)(guang)纤(xian)(xian)插入固定(ding)脑片纹状(zhuang)体的亮视(shi)野图(tu)像(Thy1-ChR2-EYFP小鼠(shu))。g, f. h中锥形光(guang)(guang)纤(xian)(xian)的光(guang)(guang)采集(ji)域(yu)(yu)ξT(x,y)，将(jiang)ξT(x,y)域(yu)(yu)与位点选择性传递光(guang)(guang)相结(jie)合(he)，产生可重构的纹状(zhuang)体子(zi)区域(yu)(yu)多位点光(guang)(guang)采集(ji)效(xiao)率域(yu)(yu)ρT(x,y)。比(bi)例尺(chi)(f−h)， 250µm。在(zai)a-c、g、h重复实(shi)验(yan)3次，结(jie)果相似。

增强学习荧光(guang)法在dna着色的中枢(shu)神经(jing)客(ke)群

而言扇形电信网络金属宽带宽带宽带线，你们应用了0.39-NA 扇形电信网络金属宽带宽带宽带线 (ψ = ~4°)和扁长切工电信网络金属宽带宽带宽带线来条件的刺激和验测Thy1-ChR2-eYFP小鼠固定不变脑片区别皮层层的荧光，其中的EYFP仅供于L2/3和L5(图3a-c)。你们量测了三大科学实验配制的ξ(x,y)、β(x,y)和ρ(x,y)场:很近深部的FF(图3a)、放入L5层的FF(图3b)和越过皮层比率的扇形电信网络金属宽带宽带宽带线 (图3c)。所谓目标的那般，扇形电信网络金属宽带宽带宽带线条件的刺激并提取了L2/3和L5层的荧光，而扁长切工电信网络金属宽带宽带宽带线在很近髋膝盖突的一名比较有限地方内募集讯号，要二次wifi定位以治理 这3个地方。最后，电信网络金属宽带宽带宽带线植物纤维钝的多少形状阻拦了电信网络金属宽带宽带宽带线的放入，而且当电信网络金属宽带宽带宽带线越过团队切片时，后移的团队如果在髋膝盖突的之前。

我们比较了三种实验配置产生的绝对信号水平(图3d)，通过调制激光功率来补偿锥形光纤的较大光学活性区域，并在每个光学表面提供相同的平均功率密度(~0.1 mW mm-2)。在这些条件下，锥形光纤在两个深度都相对于扁平切割光纤产生了更大的荧光信号(图3e)，这可以解释为在光收集和光传输中分模解复用的综合作用。在保持中等功率密度的情况下，模式分复用将较高的总照明功率分布在较宽的表面22,27。随着更多的光子被释放到组织中，更多的神经元参与到收集信号中，更多的荧光被产生和检测到，这与之前的研究结果一致，在较低的输出功率下锥形光纤比扁平切割光纤更能引起光遗传激活22。重要的是，由于光漂白依赖于每个荧光团的光(guang)暴(bao)露，当全部的光(guang)活性区域被(bei)吸收时(shi)，锥(zhui)形光(guang)纤在更大体(ti)积的组织(zhi)上的光(guang)分布允(yun)许产生更多的荧(ying)光(guang)而(er)不增加光(guang)漂白。

图4 |胃中找色光度法揭露了多巴胺对背侧纹状体和腹侧纹状体中长跑和实物赠送的各不相同体现。a，顶面，使用活体光仟传输光度检测的术地方和两种地方椎型光仟传输照射构造图。下是行为举动举动室的构造图。淡颜色空间地域表达光标所需進入盒的空间地域来驱散干净的器皿(淡颜色)中的食用颗粒剂的递送。在实物赠送完工后，不少于所需十秒的期限方能完工另1个说的是个实物赠送。b，来源于一只猫大老鼠的光度电磁波实例。上，行为举动举动期限戳是根据红外粒子束在干净的器皿中测出的。青绿色，奖赏的干净的器皿渠道;洋淡颜色，沒有实物赠送的干净的器皿渠道。中，各种动物的中时速。上端，dLight光度电磁波。淡颜色，来源于后背的电磁波;淡颜色，腹侧电磁波。c，来源于实例小鼠的大多数实验的dLight光度电磁波的热图(两种阶段中)。顶部，来源于后背的电磁波。上端，来源于腹侧的电磁波。某一行是指1个独立的实验。N = 37次实物赠送干净的器皿進入实验。N = 435例无实物赠送進入干净的器皿的实验。N = 52次中长跑开启实验。d，小鼠大多数应用程序的差不多时速和dLight光度电磁波。来源于后背的电磁波展现为淡颜色;来源于腹侧的电磁波展现为淡颜色(n = 8次，来源于4只小鼠)。困扰空间地域是指应用程序差不多值的的标准误差度。

休内空间辩认光度法

为了更深入地了解构成运动行为和奖赏驱动行为基础的神经过程，光纤光度法已被用于探测纹状体神经元的活动11-13,29。在这种情况下，锥形光纤通过使用一个远程控制的植入物对多个区域进行采样来扩展实验能力。为了支持这一论点，我们用纹状体中的锥形光纤对位点选择性荧光法进行了表征(图3f)。我们将一个0.66-NA 锥形光纤插入Thy1-ChR2- EYFP小鼠固定脑片的纹状体中，在获得ξ(x,y)场(图3g)后，我们使用位点选择性照明来产生增加输入角度时的光度测量效率ρ(x,y)场(补充图5)。正如预期的那样，随着光输入角度的增加，响应位点选择性照明的体积逐渐远离锥形光纤jian 端(图3h)。

让我门选择dLight1.1(参考价值文章30)的同时自动测量背侧纹状体和腹侧纹状体的多巴胺瞬变，在肚子里测试软件圆锥形光仟体系，这两人脑区显视出不同于的多巴胺4g信号31。让我门在这种很简单的运营性水平反射面范式中训练课小鼠，除此前一天让我门从背侧和腹侧纹状体采集而来dLight荧光(图4a, NA = 0.39)。在这种实验设计中，猴子要待在户型的旁边，功能促发吃的东西奖劢从地处户型另旁边的场所中推送到。这致使猴子从户型的旁边跑到另旁边去采集而来奖劢，并在耗用场所中的奖劢时为止移動。

我们在腹侧(ce)纹(wen)(wen)(wen)状(zhuang)(zhuang)(zhuang)体(ti)(ti)中观察到经(jing)典的(de)(de)奖(jiang)赏(shang)驱动(dong)的(de)(de)多(duo)巴(ba)(ba)胺(an)(an)(an)瞬(shun)变(bian)，其中dLight荧光在奖(jiang)赏(shang)受体(ti)(ti)进入期(qi)间增加(jia)，在无奖(jiang)赏(shang)进入期(qi)间减少(图4b-d;补充(chong)图6所(suo)示的(de)(de)所(suo)有(you)试(shi)验均为单(dan)独的(de)(de)小鼠)。然(ran)而，对于奖(jiang)赏(shang)和未(wei)奖(jiang)赏(shang)的(de)(de)受体(ti)(ti)条目，背(bei)(bei)侧(ce)dLight荧光均下降，这表明背(bei)(bei)侧(ce)纹(wen)(wen)(wen)状(zhuang)(zhuang)(zhuang)体(ti)(ti)中的(de)(de)多(duo)巴(ba)(ba)胺(an)(an)(an)释放与(yu)运动(dong)变(bian)化(hua)的(de)(de)相(xiang)关性更(geng)强(qiang)，而不是(shi)与(yu)奖(jiang)赏(shang)的(de)(de)获得(图4b-d)。此(ci)外(wai)，在奖(jiang)赏(shang)受体(ti)(ti)进入时，背(bei)(bei)侧(ce)纹(wen)(wen)(wen)状(zhuang)(zhuang)(zhuang)体(ti)(ti)和腹侧(ce)纹(wen)(wen)(wen)状(zhuang)(zhuang)(zhuang)体(ti)(ti)由行为引起的(de)(de)多(duo)巴(ba)(ba)胺(an)(an)(an)变(bian)化(hua)的(de)(de)迹象相(xiang)反，并且与(yu)多(duo)巴(ba)(ba)胺(an)(an)(an)在运动(dong)启(qi)动(dong)中的(de)(de)功能一致32,33，两(liang)个部位的(de)(de)信号在运动(dong)启(qi)动(dong)期(qi)间增加(jia)(图4b-d)。因此(ci)，虽(sui)然(ran)背(bei)(bei)侧(ce)纹(wen)(wen)(wen)状(zhuang)(zhuang)(zhuang)体(ti)(ti)和腹侧(ce)纹(wen)(wen)(wen)状(zhuang)(zhuang)(zhuang)体(ti)(ti)多(duo)巴(ba)(ba)胺(an)(an)(an)瞬(shun)变(bian)均追踪运动(dong)，但只有(you)腹侧(ce)纹(wen)(wen)(wen)状(zhuang)(zhuang)(zhuang)体(ti)(ti)的(de)(de)多(duo)巴(ba)(ba)胺(an)(an)(an)瞬(shun)变(bian)对奖(jiang)励有(you)强(qiang)烈反应。

有(you)点微型(xing)式扇形金属(shu)的设置集光大小

锥(zhui)形光(guang)纤(xian)与环境界面(mian)的(de)(de)(de)大表(biao)面(mian)允许(xu)根据感兴趣(qu)的(de)(de)(de)区域设计(ji)收集量(liang)(图(tu)5)。这(zhei)可以通(tong)(tong)过使用微纳米制(zhi)造技术来(lai)构建光(guang)纤(xian)的(de)(de)(de)锥(zhui)度(du)来(lai)实现(xian)，正如在光(guang)传输中(zhong)所显示(shi)的(de)(de)(de)那样25,26,34。在这(zhei)里，我们展(zhan)示(shi)了:(i)光(guang)收集在波导周围特定角(jiao)度(du)范围内的(de)(de)(de)限(xian)制(zhi)(图(tu)5a-d)， (ii)当光(guang)收集被限(xian)制(zhi)在沿锥(zhui)度(du)的(de)(de)(de)特定点时(shi)，在深层皮质层中(zhong)对细(xi)胞体的(de)(de)(de)观察(图(tu)5e-l)， (iii)选择(ze)性照(zhao)明(ming)和从两个光(guang)学窗口收集，通(tong)(tong)过操纵激发激光(guang)束分别解决(图(tu)5m,n)。

为了限制光的收集到波导表面的一半，我们对其对面的高反射铝层进行热蒸发(图5a)。半包被的TF在光学表面的ξ(x,y)(图5b)和剖面(图5c)与未包被的双探针在形状和收集到的光子数方面相似。因此，金属涂层并没有实质性地改变检测到的信号，这表明几乎所有进入未涂层锥度的光子都经历了介电全内反射，这是(shi)由半(ban)涂层光纤中(zhong)的(de)(de)金属层强迫的(de)(de)。我们将半(ban)包被的(de)(de)锥(zhui)形光纤插入由Thy1启动子(zi)(zi)控制的(de)(de)表达EYFP的(de)(de)固定脑切片中(zhong)，在(zai)组(zu)织中(zhong)测(ce)试了该装置(zhi)的(de)(de)侧采集特(te)性(图5c)。我们获得(de)了一个双光子(zi)(zi)的(de)(de)表荧(ying)光图像(xiang)和(he)ξ(x,y)场，并发现尽管(guan)在(zai)光纤周围都产生(sheng)了荧(ying)光，但光纤PMT只获得(de)了在(zai)光纤的(de)(de)未涂覆部(bu)分附近产生(sheng)的(de)(de)荧(ying)光(图5d)。

图5 |用微结构锥形光纤设计集光体积。a，左，半金属化TF的扫描电子显微图(SEM)。右，在pbs -荧光素溶液中，ξ(x,y)场对半涂覆的0.39-NA TF。b， ξ(x,y)场在pbs -荧光素溶液中。等值线分别用白色、黄色和红色表示每像(xiang)(xiang)素5、10和(he)20个光(guang)子(停留(liu)时间3.2µs)。c， ξ(x,y)对(dui)于半涂(tu)覆锥(zhui)(zhui)形(xing)光(guang)纤(红(hong)色(se))和(he)未涂(tu)覆锥(zhui)(zhui)形(xing)光(guang)纤(蓝色(se))的(de)(de)(de)(de)(de)场分布(bu)。d，在(zai)固(gu)定的(de)(de)(de)(de)(de)脑(nao)切片(pian)中收集(ji)半涂(tu)层TF (Thy1-ChR2-EYFP小(xiao)鼠(shu))。从左(zuo)到右:双(shuang)光(guang)子表荧(ying)光(guang)，ξ(x,y)场，合并表荧(ying)光(guang)(品红(hong))和(he)ξ(x,y)(青色(se))。比(bi)例(li)(li)(li)(li)尺(chi)(a-d)， 250µm。e，设(she)置用于表征从光(guang)学窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)的(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)收集(ji)。插(cha)(cha)图(tu)(tu)，正方形(xing)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)的(de)(de)(de)(de)(de)SEM显微图(tu)(tu)(W = ~45µm, L = ~ 1250µm)。f，与L和(he)W相(xiang)比(bi)，由采集(ji)等值面包围的(de)(de)(de)(de)(de)pbs -荧(ying)光(guang)素溶液的(de)(de)(de)(de)(de)采集(ji)量(liang)分别为(wei)zui大(da)采集(ji)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)10%、20%、40%、60%、80%(补充图(tu)(tu)6)。g，固(gu)定脑(nao)片(pian)(Thy1-ChR2-EYFP小(xiao)鼠(shu))的(de)(de)(de)(de)(de)方形(xing)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)光(guang)采集(ji)(W = ~45µm, L = ~750µm);该图(tu)(tu)像(xiang)(xiang)显示了ξ(x,y)域(青色(se))与同(tong)时获得的(de)(de)(de)(de)(de)双(shuang)光(guang)子表观荧(ying)光(guang)图(tu)(tu)像(xiang)(xiang)(品红(hong))的(de)(de)(de)(de)(de)叠加;比(bi)例(li)(li)(li)(li)尺(chi)，500µm。插(cha)(cha)入(ru)(ru)，放大(da)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou);比(bi)例(li)(li)(li)(li)尺(chi)，50µm。h，在(zai)光(guang)学窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)上方随高(gao)度增加的(de)(de)(de)(de)(de)Z-stack(0、20、40、60µm)。锥(zhui)(zhui)形(xing)光(guang)纤配置文件和(he)窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)位置用白色(se)表示。比(bi)例(li)(li)(li)(li)尺(chi)，10µm。i，与g一(yi)样，当TF的(de)(de)(de)(de)(de)时间窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)W = ~20µm时，L = ~230µm;比(bi)例(li)(li)(li)(li)尺(chi)，100µm(插(cha)(cha)图(tu)(tu)，10µm)。l，如h，对(dui)于W = ~20µm的(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)学窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou):高(gao)度为(wei)0、15、30、50µm的(de)(de)(de)(de)(de)z-stack;比(bi)例(li)(li)(li)(li)尺(chi)，10µm。m，设(she)置用于选择地点的(de)(de)(de)(de)(de)照明和(he)收集(ji)。锥(zhui)(zhui)形(xing)光(guang)纤被淹没在(zai)pbs -荧(ying)光(guang)素滴中。激(ji)光(guang)束脉冲(chong)(10 Hz, 50 ms, 473 nm)在(zai)受控θ下注入(ru)(ru)(补充图(tu)(tu)7c)。比(bi)例(li)(li)(li)(li)尺(chi)，500µm。n，从W1和(he)W2窗(chuang)(chuang)(chuang)(chuang)口(kou)测量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)荧(ying)光(guang)信号，通(tong)过操纵(zong)θ独(du)立(li)激(ji)活(荧(ying)光(guang)信号通(tong)过减去自身荧(ying)光(guang)校正)。c、d、g-l、n实验重复(fu)3次，结果相(xiang)似。

从其(qi)中任何程(cheng)度的光(guang)学玻璃菜单栏获得光(guang)

我们探索了在全铝涂层的TF上制造光学窗来进一步限制收集体积的可能性，我们使用聚焦离子束研磨来选择性地去除锥形特定区域的金属25,26。为了优化该装置，我们如上所述对PBS-荧光素溶液(30µM)中光学窗口的光收集进行了表征。我们制作了不同边长(W = 60、30、15µm)的光学窗平方的探针(NA = 0.39)，放置在距离光纤jian 端不同距离(L = 230、750、1,250µm)处(图5e、f)。这些设备的体积收集图(补充图7a)显示，较大的窗口导致较大的收集量(图5f)。然而，尽管靠近jian 端的(de)窗口(kou)(kou)从略大的(de)体积(ji)中收集(ji)(ji)，但在较大的(de)锥(zhui)形截面上的(de)窗口(kou)(kou)具有相(xiang)似的(de)收集(ji)(ji)特性(xing)(图5f)。

我们在Thy1-ChR2-EYFP小鼠的固定脑片上，通过采集ξ(x,y)场与同步外荧光成像相关联，测试了微结构锥形光纤的光学性能。我们发现，对于窗宽W = ~45µm，位于距锥尖L = ~750µm的锥形光纤，光集合与光学窗口位置共定位，其集合叶不垂直于纤维轴，而是指向锥尖(图5g)。这一特性与来自光学窗的选择性光传递密切相关25，因为它允许在深度上与细胞体积进行界面，具有高空间选择性(图5h)。此外，从光学窗口附近的区域获得的三维荧光堆栈(侧W = ~45µm, L = ~750µm)(图5h和补充图7b)显示了光度图和表观荧光成像的精确匹配。我们使用窗口宽度W = ~25µm的锥形光纤得到了类似的结果，锥形光纤位于距jian 端L = ~230µm处(图5i, L)。

正如我们所展示的，对于未涂覆的锥形光纤，可以利用分模解复用策略选择性地激发和收集来自同一锥形光纤不同截面的两个光学窗口的荧光(图5m和补充图7c)。为此，我们将微结构锥形光纤浸入荧光素滴中，并在不同的输入角度注入473 nm的激光束，以每次选择一个窗口(补充图7c)。我们用声光调制器(10 Hz, 50%占空比方波)调制激光功率时，用光电探测器测量采集(ji)到的荧光信(xin)号(图(tu)5n)。荧光在每个窗口位置被选择(ze)性(xing)激发，表明(ming)锥形(xing)光纤可以选择(ze)性(xing)地(di)照亮(liang)和收集(ji)来(lai)自两个受(shou)限区域的光(图(tu)5m,n和补充图(tu)7c)。

图6 |采取远场影像完成强度判别光仟测光的测试方法。a、远场测试荧光支撑八时多路多路复用，上升强度首选性。b，经由全NA敏感完成远场测试，完成依托于返向传播推广荧光的kT值的纯分模解多路多路复用。Fluo，荧光信息;Exc，提高光。

热议

在(zai)神(shen)经科(ke)学(xue)中，从大(da)脑中表(biao)达的(de)(de)活动指示器获(huo)取荧(ying)光信号是一项强大(da)的(de)(de)技术(shu)35,36，可植入式波导系统(tong)将极(ji)大(da)地造福神(shen)经科(ke)学(xue)领域，该系统(tong)可配置为有效和选(xuan)择性地收集感兴趣区域的(de)(de)光。此外，本文中提(ti)出(chu)的(de)(de)方法可以在(zai)使(shi)用远场检测来获(huo)得光纤光度实验(yan)中的(de)(de)深度选(xuan)择性方面打(da)开进一步的(de)(de)视角(jiao)(图6)。

我们设想应用锥形光纤探针从散射组织中收集荧光，将有助于解剖脑深部多个功能区的贡献，同时为现有的光学方法提供一个通用的补充。基于锥形光纤的分模解复用的光度测定方法也可以潜在地扩展到大类别的软的、生物的、活组织，其中大脑代表了散射特性方面具挑战性的情况之一，考虑到散射长度和各向异性。在这个框架中，锥形光纤为现有的光收集设备增加了有益的功能，使用了扁平切割光纤或µLED/光电探测(ce)器系统(tong)无(wu)法实(shi)现(xian)的不同(tong)配置10。

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